Пцр количественный: зачем и как проводится.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это лабораторный метод определения ДНК и РНК. Впервые он был опробован почти полвека назад американцем Кэри Муллисом. Этот сверхчувствительный анализ способен определить носителя генома по одной исходной молекуле, содержащейся в крови, слюне или коже.

Метод ПЦР имеет огромные перспективы, находит применение не только в медицине, но и в генной инженерии, и в криминалистике. С его помощью клонируют и создают новые виды ДНК, определяют степень родства. По кусочку эпителия, найденного на месте преступления, устанавливают преступника.

Анализ ПЦР на гепатит – что это и зачем делают?

Почему необходим анализ ПЦР при подозрении на гепатит С, что это такое?

Вирус гепатита С – РНК содержащий вирус, имеет 6 генотипов и до 500 субтипов. Из всех гепатитов этот вирус обладает самой высокой мутационной способностью и преодолевает защитный барьер иммунной системы. Из общего числа заболевших гепатитами, вирус С стал причиной 70% случаев хронической формы и 30% цирроза и рака печени.

При болезнях печени нужно принимать..

• Специальный препарат, основанный, на натуральных веществах
• Цена на препарат
• Отзывы о лечении

Не является лекарством. Требуется консультация специалиста.

Эффективный способ очистки печени

1. Всего 1 раз в день, по 3 капли
2. Результаты лечения
3. Инструкция по применению

Не является лекарством. Требуется консультация специалиста.

Суть способа: часть исследуемого гена с помощью специальных ферментов и условий заставляют размножаться в пробирке. Анализ ПЦР позволяет определить штамм вируса, без которого невозможно провести результативное лечение: каждый генотип по-разному чувствителен к антивирусным препаратам. Применяется два типа ПЦР:

Важно! Найдено уникальное средство для борьбы с болезнями печени! Принимая его курсом можно всего за неделю победить почти любую болезнь печени! Читать далее >>>

• качественный;
• количественный.

Противовирусная терапия нуждается в постоянном контроле, чтобы своевременно скорректировать лечение, для этих целей также используется полимеразная цепная реакция.

Качественный и количественный ПЦР

ПЦР качественный на гепатит С дает ответ: есть ли в крови пациента штамм вируса С и какой именно. Генотипирование необходимо для уточнения диагноза, прогноза заболевания и определения сроков лечения.

По принятой классификации ген обозначается числом, а подтип маленькой латинской буквой.

Расшифровка таблицы генотипов вируса С:

• Генотип 1а, 1b, 1с
• Генотип 2а, 2b, 2с, 2 d
• Генотип 3а, 3b, 3с, 3d, 3e, 3f
• Генотип 4а, 4b, 4с, 4d, 4e, 4f, 4g, 4 h, 4 i, 4 j
• Генотип 5 а
• Генотип 6 а

Самые распространенные генотипы 1,2,3. В России чаще всего встречаются 1а, 1b, 2 и 3 штаммы вируса С.

• Генотип вируса 1b труднее других поддается лечению, в 90% переходит в хроническую форму, из которых 30% перерождаются в рак или цирроз печени.
• Генотипы 2а и 3а имеют степень хронизации 33-50 %, более отзывчивы на противовирусную терапию.
• При подтверждении присутствия вируса проводится ПЦР количественный на гепатит С, с помощью которого рассчитывают количество молекул РНК, находящихся в лабораторном образце больного.

Расшифровка анализа

Качественный ПЦР анализ имеет два ответа:

• отрицательный;
• положительный.

ПЦР отрицательный означает, что возбудитель в образцах крови не обнаружен.
Положительный ответ свидетельствует об обратном: обнаружены РНК того или иного генотипа вируса С.

Вероятность достоверности результата равна 95%. Остальные 5% — это ошибка по вине человека. Такая возможность допускается из-за высоких требований к проведению исследования:

• правил хранения реактивов;
• соответствующей квалификации медперсонала;
• чистоты биоматериала.

Сам набор ПЦР имеет 100% диагностическую точность.

Количественный ПЦР РНК гепатита С позволяет определить вирусную нагрузку на организм больного. С его помощью:

• уточняется стадия заболевания (острая, хроническая);
• определяется эффективность противовирусного лечения;
• выясняется необходимость биопсии печени.

В некоторых случаях больной не ощущает никаких признаков болезни, в то время как методом ПЦР установлено инфицирование ВГС. Это означает, что заболевание находится на ранней стадии развития либо в хронической форме. Для уточнения диагноза необходимы дополнительные исследования, для скорейшего начала противовирусного лечения.

Вирусная нагрузка при гепатите С

Вирусная нагрузка показывает активность печеночного вируса, насколько активно происходит его размножение.

Что это?

ПЦР количественный гепатита С измеряется в Международных Единицах на 1 мл или МЕ/мл, что означает, сколько в 1 мл исследуемой крови обнаружено копий рибонуклеиновой кислоты определенного штамма вируса С.

Какая считается высокой, какая низкой?

Анализ на вирусную нагрузку позволяет определить наличие вирусных РНК в концентрации 50 МЕ/мл. Вирусная нагрузка в норме – это когда ПЦР не обнаружено ни одной молекулы РНК ВГС.

Таблица вирусной нагрузки:

• низкая – концентрация от 600 МЕ/мл 3*104 МЕ/мл;
• средняя – концентрация от 3*104 МЕ/мл до 8*105МЕмл;
• высокая – уровень более 8*105 МЕ/мл.

Низкая вирусная нагрузка – это сигнал, что терапевтическое лечение подобрано правильно, и прогноз на излечение от гепатита С – благоприятный.

Высокая концентрация вирусных клеток свидетельствует, что болезнь находится в острой фазе. Кровь пациента является опасным источником инфекции.

Вирусная нагрузка, показатели которой находятся на среднем уровне, характеризует либо хроническую стадию ГВС, либо может иметь два тренда развития: к ее повышению или понижению.

Внимание! Количественное тестирование проводится на протяжении всей антивирусной терапии: через 4, 12 и 24 недели, цель которой – снизить вирусную нагрузку.

По ее окончании – через 6 месяцев делается контрольная ПЦР.

Стоимость ПЦР диагностики

Для справки! Пройти диагностику на гепатит С или любое другое инфекционное заболевание можно по направлению врача или самостоятельно.

Поводом для беспокойства должны стать следующие симптомы:

• общая слабость;
• изменение цвета кожи, глазных склер, выделений;
• тошнота;
• снижение аппетита;
• боли в мышцах и суставах;
• тяжесть в правом подреберье;
• повышенный уровень в крови АСТ и АЛТ.

При контакте с инфицированными больными, в предоперационный период, при гемодиализе также рекомендовано обследование.

Государственные клиники делают анализ крови на ПЦР бесплатно, если имеется направление от инфекциониста или гепатолога.

Платные услуги по ПЦР диагностике оказывают во всех крупных российских городах. Стоимость зависит от типа теста, имеющегося оборудования, сроков проведения и других факторов.

Качественный ПЦР анализ в Москве и С-Петербурге обойдется от 600 до 900 руб. В регионах – от 300 до 800 руб.

Определение вирусной нагрузки гепатита С будет стоить 17000-22000 руб. Для прочих видов инфекции цена количественного исследования: 1200-10000 руб.

Достоинства и недостатки метода ПЦР

В чем преимущества метода полимеразной цепной реакции перед другими диагностическими способами?

1. Широкий спектр применения. С помощью ПЦР, используя типовое оборудование, можно определить любой вирус.
2. Точность определения возбудителя. Применяя различные комбинации ферментов и технику проведения анализа, достигается 100% спецификация исследования для обозначенной инфекции.
3. Высокая чувствительность. Методика позволяет выявить присутствие в крови одной молекулы вируса.
4. Оперативность. Качественный анализ бывает готов через несколько часов, количественный – через двое суток.
5. Диагностика вируса в инкубационном периоде. При ПЦР возбудитель определяется не по наличию антител, когда уже имеется иммунная реакция организма, а до начала патологического процесса, что облегчает лечение.

Недостатки ПЦР являются следствием ее достоинств:

• для чистоты анализа требуется высочайшая степень чистоты
• , в том числе воздуха в лаборатории, чтобы «чужие» ДНК не попали в исследуемый образец;
• высокие требования к персоналу, осуществляющему забор и анализ биоматериала.

Источник: http://ZaPechen.ru/bolezni-pecheni/gepatit/c/ptsr-analiz.html

Что показывает анализ ПЦР на гепатит С? Как его сдавать?

Для постановки диагноза «хронический вирусный гепатит С (ХВГС)» требуется комплексное обследование человека, которое включает клинические, лабораторные и инструментальные исследования. Важным с точки зрения диагностики для постановки правильного диагноза является метод ПЦР – полимеразная цепная реакция.

Содержание Что показывает этот анализ и зачем он нужен? Три вида ПЦР анализов Как сдавать анализ ПЦР на гепатит С? Результат анализа ПЦР на гепатит С

Что показывает этот анализ и зачем он нужен?

Этим лабораторным методом обнаруживают РНК вируса гепатита С в крови человека.

Вместе симмуноферментным анализом (ИФА)на антитела к вирусу, ПЦР используют для постановки диагноза ХВГС и генотипа его возбудителя.

Это исследование является одним из новейших методов лабораторной диагностики. Его достоверность при ХВГС превышает 97%, что считается очень хорошим показателем для исследований.

Существует три ПЦРанализа крови при ХВГС: качественный, количественный и генотипирование вируса. Первое исследование (качественный анализ) на вирус обнаруживает его в крови, поэтому используется только для постановки диагноза.

Второе (количественное) исследование определяет степень вирусной нагрузки на организм, поэтому применяется для контроля эффективности терапии.

Третий ПЦР (генотипирование) уточняет диагноз, устанавливая генотип вируса, что очень важно для назначения правильного противовирусного лечения.

Суть методики полимеразной цепной реакции заключается в использовании ферментов, которые многократно размножают генетический материал возбудителя в биоматериале.

В процессе такой репликации пробирку с кровью несколько раз подогревают и охлаждают до температуры, необходимой для ускорения ферментативной реакции.

В результате этих манипуляций количество вирусного генома многократно увеличивается, что позволяет его выявить даже при минимальном количестве.

ПЦР диагностика имеет много преимуществ перед другими лабораторными исследованиями:

• высокая чувствительность – 97-98%;
• гарантированная аналитическая специфичность (выявляет именно тот возбудитель, который требуется найти, а не его родственный штамм);
• быстрота проведения (требуется не более 2 суток для получения заключения).

Три вида ПЦР анализов

Качественный ПЦРанализ назначается всем пациентам, у кого ИФА-анализом были выявлены антитела к вирусу ХВГС. После проведения качественного ПЦР может быть получено два варианта ответа: «РНК обнаружено» или «РНК не обнаружено». Чтобы обнаружить в крови минимальное количество вируса, необходимы тест-системы с чувствительностью не менее 50 МЕ/мл. Если концентрация вируса в крови больного будет меньше, чем может определить диагностикум, то результат исследования может быть и ложноотрицательным. Чтобы избежать такой диагностической ошибки, лаборатории, осуществляющие ПЦР-диагностику, должны быть обеспечены высокочувствительными тест-системами. В лаборатории «Инвитро», к примеру, используются тесты с чувствительностью от 15 МЕ/мл. Информацию о чувствительности тестов работники лаборатории обязаны предоставлять пациентам и врачам по их первому требованию.

Количественный анализ ПЦРопределяет степень виремии, то есть концентрацию возбудителя в крови, вирусную нагрузку.

Результат этого исследования, в отличие от качественного ПЦР, выражается цифрами, например, 2×10*6 МЕ/мл, что означает 2 миллиона международных единиц в 1 мл крови. Часть лабораторий применяет другой показатель – число копий/мл.

Эти два показателя легко конвертировать: 1 международная единица равна 4 копиям РНК. Таким образом, 2×10*6 МЕ/мл будет означать, что в крови больного обнаружено 8×10*6 копий вирусной РНК в 1 мл, т.е. 8 млн. копий в 1мл крови.

Генотипирование– это определение одного из шести генотипов вируса.

От генотипа возбудителя зависит клиническая картина, скорость развития осложнений со стороны печени и прогноз для дальнейшей жизни пациента.

Генотип вируса очень важен уже на стадии постановки диагноза, поскольку от его правильного определения зависиткомбинация препаратови длительность терапевтического курса, который будет назначен больному.

Однако даже такое казалось бы «идеальное» лабораторное исследование имеет свои минусы:

• в ходе исследования происходит репликация генетического материала всех возбудителей, даже неживых, что может исказить результат. Поэтому для осуществления контроля эффективности с помощью ПЦР повторный анализ проводят не ранее, чем через 2 месяца после предыдущего, чтобы погибшие вирусы успели «покинуть» организм больного;
• часть вирусного генома, который определяют с помощью тест-систем, теоретически может присутствовать и в других вирусах или микроорганизмах, поэтому есть вероятность ложноположительного ответа;
• вирусы быстро мутируют. Иногда скорость и степень мутирования вируса настолько высока, что тест-система перестает улавливать их геном. Как следствие, возможен ложноотрицательный результат.

Для нивелирования этих недостатков, производители лабораторных тест-систем для ПЦР диагностики постоянно проводят их испытания, в том числе на перекрестные реакции и на чувствительность к тому или иному генотипу вируса.

Как сдавать анализ ПЦР на гепатит С?

Чтобы заключение обследования методом ПЦР были достоверными, необходимо строго соблюдать правила подготовки к его проведению:

• исследование проводится на голодный желудок (глюкоза, жиры, минералы, попадающие в кровь из пищи, могут повлиять на скорость и качество ферментной реакции);
• разрыв между последним приемом пищи и отбором крови для анализа должен составлять не менее 8 часов;
• накануне исследования запрещено принимать алкоголь и употреблять жирную пищу, период выведения которых затяжной;
• за сутки до похода в лабораторию следует избегать сильных физических и эмоциональных нагрузок;
• до момента забора крови не рекомендуется курить.

Чтобы избежать появления ложных заключений, предполагаемому больному необходимо прийти в лабораторию немного раньше, чем будет проведен забор крови. Нужно 15-20 минут для того, чтобы человек отдышался, успокоился. Адреналин, присутствующий в крови после быстрой ходьбы, может повлиять на результат обследования.

Если направляемый на анализ пациент принимает какие-либо лекарственные препараты, об этом он должен уведомить врача. Вполне возможно, что от приема некоторых из них придется на некоторое время отказаться (если это возможно).

Результат анализа ПЦР на гепатит С

Расшифровкой результатов занимается врач-лаборант той лаборатории, которая проводила анализ. Расшифровка – это определение отклонения полученного результата от нормы.

Норма показателей устанавливается непосредственно производителем тест-системы, которая используется лабораторией для диагностики.

Поэтому не стоит удивляться, что в одних лабораториях вирусную нагрузку определяют в МЕ/мл, а в других – в копиях/мл.

Получив заключение, его нужно уметь правильно трактовать. Трактовкой результатов исследования должен заниматься лечащий врач больного гепатитом С. Только после объективного, инструментального и лабораторного обследования пациента, врач может получить достаточное количество данных для грамотной трактовки полученных результатов ПЦР.

Показатели количественного анализа трактовать сложнее. Он показывает степень вирусной нагрузки на пациента. Даже среди гепатологов нет единого мнения по поводу того, как трактовать обнаруженную виремию. Большинство врачей склоняются к тому, что высокой нужно считать нагрузку более 8×10*5 МЕ/мл. Очень высокой считается нагрузка более 1×10*7 МЕ/мл, а низкой – менее 4×10*5 МЕ/мл.

Степень вирусной нагрузки говорит о вирулентности (агрессивности) вируса: чем больше его количество в крови, тем быстрее могут развиватьсяосложнения со стороны печени.

Высокая концентрация вируса в крови беременной женщины повышает вероятность его проникновения через гематоплацентарный барьер к плоду.

Виремия также влияет на эффективность лечения: при низких цифрах результативность терапии выше, чем при высоких.

Для того, чтобы быть уверенным в достоверности проведенного анализа ПЦР на гепатит С, нужно отдавать предпочтение только тем лабораториям, которые хорошо себя зарекомендовали. Ценовая политика при этом не должна играть первостепенную роль.

Источник: https://Sofosbuvir-Daclatasvir.ru/article-item/analiz-pcr-na-gepatit-s/

Что такое метод ПЦР и когда анализ необходим

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)— современный метод исследования биоматериала, направленный нараннее выявление вирусов ибактерий ворганизме человека. Анализ ПЦР является одним изнаиболее точных среди современных методов иимеет множество преимуществ.

Суть метода. Перечень диагностируемых заболеваний

Молекулы ДНК, содержащиеся всоставе любого вируса или бактерии, уникальны посвоему строению. Суть метода заключается вспецифической обработке биоматериала, вследствие чего увеличивается количество ДНК молекул. После установления ихтипа определяют возбудителя иставят точный диагноз.

Спомощьюметода ПЦРможно диагностировать практически все существующие бактериальные ивирусные заболевания. Для исследования используют нетолько кровь, ноидругие биоматериалы— мокрота, сперма, моча, соскобы эпителия, плазма, сыворотка ибиологические жидкости (околоплодные воды, суставная жидкость).

Полимеразная цепная реакция позволяет выявлять такие заболевания, как:

• гепатиты;
• вирусы герпеса;
• ВИЧ-инфекцию;
• токсоплазмоз имикоплазмоз;
• энтеровирусная инфекция;
• мононуклеоз;
• туберкулез;
• сальмонеллез игарднереллез;
• краснуха;
• папилломавирусная инфекция.

Чтобы избежать аномалии развития плода беременным женщинам необходимосдать анализ ПЦР.

Преимущества анализа ПЦР

Полимеразная цепная реакция имеет множество преимуществ перед другими методами исследования.

1. Вотличие отдругих микробиологических исследований ПЦР проводят втечение нескольких часов.
2. Анализ имеет 100% точность.
3. Возможность использования для анализа любого биологического материала.
4. Спомощью одного образца биологического материала можно сделатьанализ наинфекцииразличного вида.
5. ПЦР метод позволяет выявить возбудителя когда заболевание еще неразвивается ворганизме. Также анализ позволяет выявлять носителей таких опасных заболеваний как ВИЧ ивирусные гепатиты.

Лаборатории, где проводят анализ биологического материала, оснащены высокотехнологичным оборудованием, вчастности специальными биологическими фильтрами для очистки воздуха отпосторонних частиц. Если несоблюдаются все правила работы сбиоматериалами, результаты анализов могут быть неправильными.

Результаты исследования

Метод исследования ПЦР бывает качественным иколичественным.ПЦР качественныйможет иметь положительный или отрицательный результат. Если результат отрицательный, тоэто означает что возбудитель ненайден. Если результат положительный, это свидетельствует оналичии инфекции.

ПЦР количественныйуказывает наколичество возбудителя вбиологическом материале больного, чем его больше— тем тяжелее течение болезни.

Случается, что при положительном анализе пациент чувствует себя хорошо иненаблюдает никаких симптомов. Это означает, что возбудитель обнаружен наначальной стадии заболевания илечение необходимо начать как можно скорее.

ПЦР диагностика является одной изсамых точных, именно это позволяет нетолько обнаружить болезнь наранних стадиях, ноиконтролировать ход лечения.

Источник: https://boleznivse.ru/diagnostica/chto-takoe-metod-ptsr-i-kogda-analiz-neobhodim.html

Полимеразная цепная реакция — информация для пациентов

четверг, июля 18, 2013 — 08:33

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — сложный лабораторный метод, широко применяемый в медицине и других отраслях науки. В своё время ПЦР диагностика стала большим прорывом в науке. Можно сказать, что это — одно из важнейших открытий 20 века в медицине. За открытие метода Кери Муллис, учёный-биохимик, получил в 1993 году Нобелевскую премию.

С давних пор инфекции собирали с человечества горькую дань. Одна только чума унесла сотни тысяч жизней в средние века. В успешной борьбе с эпидемиями важным моментом является точная и своевременная диагностика.

ПЦР исследования как правило проводятся в лаборатории при клинике. Несмотря на то, что ПЦР тест на инфекцию достаточно дорог, цена компенсируется высокой точностью. Для установления точного диагноза достаточно сделать анализ один раз. При использовании других методов могут потребоваться дополнительные или повторные анализы.

Как проводится анализ на инфекционные заболевания

ПЦР обследование может проводиться с любыми биологическими материалами, полученными от больного человека. В качестве образцов могут служить кровь и другие биологические, физиологические и патологические жидкости и среды. Можно провести ПЦР мочи или кала.

Чаще всего методом ПЦР определяют вирусные и атипичные инфекции, так как они могут не поддаваться обычной диагностике из-за особенностей вызываемого ими патологического процесса. Для того, чтобы диагностировать эти инфекции, необходимо время, в течение которого организм начнёт вырабатывать антитела, которые и определяются серологическими методами. Однако в ряде случаев это неприемлемо.

С помощью ПЦР вирус иммунодефицита человека может быть определён уже через дни или недели, максимально точно, без характерного для других методов периода серонегативного окна. (Серонегативное окно — промежуток от момента заражения, в который организм ещё не начал вырабатывать достаточное для определения количество антител).

ПЦР диагностика туберкулёза также имеет больше преимуществ, по сравнению с анализами мокроты или флюрографией. Не нужно подвергать облучению организм, нет необходимости собирать мокроту.

• Метод проведения ПЦР — ин витро означает лабораторное определение инфекции в изолированных от больного образцах.
• Для проведения полимеразной цепной реакции необходим набор специальных реактивов.

В пробирки с реактивами вносят исследуемый материал. Пробирки помещают в специальный прибор — ПЦР амплификатор. Он служит для амплификации (увеличения числа) искомых фрагментов ДНК или РНК.

ПЦР амплификатор запускается в циклическом режиме. Каждый цикл, если в образцах присутствует последовательность ДНК или РНК возбудителя, в растворе накапливаются копии фрагментов этих нуклеиновых кислот.

Можно определить как присутствие возбудителя, так и его количество в образцах.

Типы ПЦР

• ПЦР — отрицательно, искомый возбудитель в образцах не обнаружен;
• ПЦР — положительно, в образцах обнаружены последовательности, характерные для того или иного возбудителя.

Когда результат ПЦР положительный, это с 95% точностью свидетельствует о наличии диагностируемой инфекции. Точность ПЦР наборов, используемых для диагностики, достигает 100%.

5% ошибочных результатов обычно зависят от человеческого фактора. Так, нарушения правил хранения реактивов и техники проведения исследования могут значительно снизить точность анализов.

Количественный ПЦР анализ определяет такое понятие, как вирусная нагрузка. При этом можно определить, сколько в образцах, полученных от больного, содержалось комплектов ДНК возбудителя. Чем больше — тем тяжелее протекает инфекция. Также можно определить по снижению вирусной нагрузки успешность лечения.

Сдача биоматериала на ПЦР

Сдача ПЦР анализов проводится в клинике, обычно с утра. Во время визита к врачу вам сообщат, что нужно сдавать: кровь, мочу, мазок или соскоб. ПЦР способна определять возбудителей независимо от степени загрязнения материала.

В теории для положительного анализа достаточно присутствие в образцах всего одного возбудителя. На практике стараются создать более благоприятные условия. Для этого существуют некоторые правила:

• если сдаёте мазок или соскоб из половых органов, следует воздержаться от половых актов за 3 дня до сдачи анализа;
• не следует накануне сдачи анализов подмываться или спринцеваться с антибактериальными средствами;
• за 3 часа до взятия мазка из уретры следует потерпеть и не мочиться.

В случае, когда пациент сдаёт кровь, можно не придерживаться этих правил.

Результаты исследования

Результаты ПЦР обычно готовы уже через сутки после сдачи анализов. Качественный анализ выглядит просто. ПЦР расшифровка не требуется, так как обычно в первой графе указывается возбудитель, во второй — результат. Например, так:

В скобках указывается метод — ПЦР. Сделать интерпретацию не сложно. У пациента из примера обнаружен качественным методом ПЦР цитомегаловирус (ЦМВ) и герпес. Уреаплазма и хламидия: возбудители инфекции не обнаружены.

Где можно сделать ПЦР

Важно сдавать анализы в клинике, хорошо себя зарекомендовавшей. Несмотря на то, что метод очень точен, на его результаты влияет соблюдение протокола исследования.

Не стоит искать клинику, руководствуясь результатами запросов в поисковой системе, типа: ПЦР Москва, где делать или ПЦР Ставрополь клиника.

Как правило, в каком месте лучше делать анализ методом ПЦР, рекомендует ваш лечащий врач.

Если результат ПЦР положительный, необходимо сделать повторное исследование в другой лаборатории. Это исключит ошибку, зависящую от человеческого фактора.

Embedded video for Полимеразная цепная реакция — информация для пациентов

Источник: http://www.probirka.org/biblio/polezno/5189-polimeraznaya-tcepnaya-reaktcia-informatcia-dlya-patcientov.html

Как долго делается анализ ПЦР при различных инфекциях

Наши преимущества:

• Недорого прием врача от 900 рублей
• Срочно анализы в день обращения от 20 минут до 1 дня
• Близко 5 минут от метро Варшавская и Чистые пруды
• Удобно работаем каждый день с 9 до 21 каждый день (включая праздники)
• Анонимно!

Анализ ПЦР— самый чувствительный иточный метод, используемый для диагностики инфекций, передающихся половым путем. Его применяют нетолько при ЗППП, ноидля оценки условно-патогенной микрофлоры влагалища, кишечника, дыхательной системы. Сроки ПЦР различны для разных инфекций изависят отварианта выполнения анализа: качественного или количественного.

Сколько готовится анализ ПЦР больше всего волнует, конечноже, пациентов свенерическими заболеваниями или сподозрением наних. Потому что очень важно ивовремя начать лечение, инезаразить близких людей.

Для большинства половых инфекций срок выполнения качественного ПЦР анализа, который как раз иопределяет наличие той или иной инфекции, составляет 1 день. Засутки можно обнаружить хламидии, микоплазмы, уреаплазмы, гарднереллы, трихомонады, гонорею, герпес, цитомегаловирус, ВПЧ, кандиду имногие другие виды микроорганизмов, вызывающих ЗППП. Материал для исследования— это обычно:

1. Соскоб изуретры, сголовки полового члена или влагалища.
2. Соскоб сослизистой оболочки ротоглотки, конъюнктивы, прямой кишки.
3. Соскоб сэрозий иязвочек.
4. Моча.
5. Секрет простаты, сперма.
6. Мокрота, слюна.

Несколько дольше выполняются количественные анализы ПЦР, которые определяют нетолько возбудителя, ноиего количество наслизистой оболочке или вбиологической жидкости. Срок такого ПЦР анализа 2–3 дня.

ДНК диагностика ИППП проводится нетолько при помощи соскобов. Для ряда инфекций берут кровь иопределяют наличие вирусов в1мл. Такие исследования необходимы при обследовании наВИЧ, гепатиты, ЦМВ, герпес-вирусы, токсоплазмоз.

Сколько дней делают ПЦР наВИЧ волнует неменьше, чем при диагностике бактериальных ЗППП. Дело втом, что этот анализ является самым ранним изанализов наСПИД/ВИЧ ипоказывает наличие РНК вируса иммунодефицита, когда остальные анализы еще нереагируют.

Качественные ПЦР анализы крови наВИЧ, гепатиты идругие инфекции восновном делаются до3 дней. Количественные могут занимать 5–7, иногда до14.

Сколько готовится анализ ПЦР зависит нетолько отвида выявляемого вируса или бактерии, ноиотлаборатории, которая его выполняет. Внаших клиниках доставка исследуемого материала производится втечение нескольких часов непосредственно влабораторию.

Поэтому сроки ПЦР врежиме реального времени минимальны, аточность исследования составляет 99–100%.

Анализы наших пациентов проводятся только втех клинико-диагностических лабораториях, которые наилучшим образом зарекомендовали себя ввыполнении анализа ПЦР.

Быстрее, чем описано вданной статье, анализ ПЦР выполняться неможет всилу своей технологии, так как для выращивания цепочек ДНК или РНК необходимо время.

Источник: https://www.academy-health.ru/stati/ptsr-sroki/

Полимеразная цепная реакция

Генетика
бактерий. Информация для второго занятия.

Полимеразная
цепная реакция

Полимеразная
цепная реакция – метод, позволяющий
провести многократное увеличение
(амплификацию) количества определенных
молекул ДНК в анализируемом образце (в
том числе в биологическом материале
или чистой культуре).

Главные
преимущества ПЦР как диагностического
метода в микробиологии – очень высокая
чувствительность, позволяющая обнаружение
крайне малых концентраций возбудителей
в образцах, а такжерегулируемая
специфичность, позволяющая обнаруживать
или идентифицировать возбудителей на
родовом, видовом или субвидовом уровне.

Основной недостаток ПЦР вытекает из
его крайне высокой чувствительности –
образы очень легко загрязнить ДНК из
положительного контроля, другого образца
или продукта ПЦР, что приведет к
ложноположительной реакции.

Это
накладывает жесткие ограничения на
условия, в которых производится смешивание
ПЦР и работа с готовыми продуктами ПЦР.

Проведение
ПЦР. Готовится
реакционная смесь, содержащая следующие
компоненты:

1. Выделенную ДНК из исследуемого образца,

2. Буферный раствор,

3. Ионы Mg2+ (необходимы для работы фермента),

4. Два праймера – одноцепочечныекороткие молекулы ДНК (длина чаще всегоот 18 до 24 нуклеотидов), комплементарные концам разных цепей обнаруживаемой последовательности ДНК.

5. Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов.

6. Термостойкую ДНК-полимеразу (чаще всего используется Taq-полимераза – полимераза, выделенная из Thermusaquaticus ).

Затем
данная реакционная смесь помещается в
амплификатор, который фактически
представляет собой программируемый
термостат. В амплификаторе проводится
30-40 циклов смены температур. Каждый из
этих циклов состоит из трех этапов (см.
Рис. 1):

1. Денатурация (температура 94оС) – разрываются водородные цепи, и цепочки ДНК расходятся.

2. Отжиг праймеров (температура обычно в районе 50-60оС) – к концам цепей ДНК присоединяются праймеры.

   Вообще, при снижении температуры энергетически выгоднее воссоединение исходных цепей ДНК из исследуемого образца (ренатурация), однако концентрация праймеров в реакционной смеси на много порядков больше концентрации ДНК из образца (по крайней мере, на начальных циклах ПЦР), поэтому реакция отжига праймеров протекает быстрее ренатурации ДНК. Температура отжига выбирается в зависимости от температур плавления (денатурации) праймеров.

3. Элонгация (температура обычно 72оС) – ДНК-полимераза достраивает праймеры по матрице длинных цепей ДНК. Температура соответствует оптимальной температуре работы используемой ДНК-полимеразы.

Детекция
результатов отличается в различных
вариантах постановки ПЦР и описана в
разделе «Разновидности ПЦР».

Динамика
ПЦР

На
ранних циклах ПЦР количество двухцепочечных
молекул ДНК, размер которых определяется
расстоянием между местами посадки
праймеров, удваивается с каждым циклом.
Также образуется малое количество более
длинных молекул ДНК, которым можно
пренебречь (см. Рис 2).

Таким
образом, на ранних циклах количество
продукта ПЦР описывается формулой m*2n,
где m
– исходное количество искомой ДНК в
пробе, n
– число циклов. Затем реакция выходит
на плато. Это происходит из-за накопления
продукта реакции, снижения концентрации
праймеров и дезоксинуклеотидтрифосфатов,
а также за счет повышения концентрации
пирофосфата (см. Рис 3).

• Разновидности
  ПЦР
• Конвенциональная
  ПЦР
• В
  данном варианте постановки ПЦР реакция
  идет заранее выбранное число циклов
  (30-40), после чего анализируется, произошло
  ли накопление двуцепочечных молекул
  ДНК в реакционной смеси.

Данный
вариант постановки ПЦР при использовании
в качестве способа диагностики является
качественным методом. Положительная
реакция свидетельствует о наличии хотя
бы следовых количеств искомых молекул
ДНК в образце. Отрицательная реакция
свидетельствует об их отсутствии. Количественная оценка содержания
исходных молекул ДНК в образце невозможна
из-за выхода реакции на плато.

Основным
методом выявления наличия продукта
является электрофорез в агарозном или
полиакриламидном геле. Продукты ПЦР
разделяются в геле под действием
электрического поля в соответствии с
их молекулярной массой.

В гель добавляется
интеркалирующий краситель (флуоресцирующий
в связанном с двухцепочечной ДНК
состоянии — чаще всего бромистый этидий).
Таким образом, при облучении ультрафиолетом
можно будет увидеть наличие или отсутствие
полоски, соответствующей ДНК необходимой
молекулярной массы.

При проведении ПЦР
в диагностических целях всегда ставятся
положительный и отрицательный контроли
реакции, с которыми сравниваются образцы
(см. Рис. 4).

ПЦР
в реальном времени

В
данном варианте постановки ПЦР количество
продукта ПЦР в реакционной смеси
регистрируется постоянно в ходе
протекания реакции. Это позволяет
построить кривую протекания реакции
(см. Рис. 3) и, исходя из неё, рассчитать
количество искомых молекул ДНК в
образцах.

Один
из видов проведения ПЦР в реальном
времени – с использованием
интеркалирующегокрасителя, который
добавляется прямо в реакционную смесь
(чаще всего используется SYBRGreen).

Другой вид – с использованием одного
из видов флуоресцирующих зондов,
связывающихся с участком внутри
ПЦР-продукта, что позволяет повысить
специфичность обнаружения (см. Рис
5).

Детекцияфлуоресценции происходит
непосредственно в приборе в ходе
протекания реакции.

Помимо
возможности количественного обнаружения,
существуют и другие достоинства ПЦР в
реальном времени по сравнению с
конвенциональной.

Данный вариант ПЦР
более прост, быстр, а также не требует
открывания пробирок с продуктами ПЦР,
что уменьшает вероятность загрязнения
других образцов.

Основной недостаток
– более высокая стоимость амплификатора
со встроенной возможностью
детекциифлуоресценции по сравнению с
обычным.

Цифровая
количественная ПЦР

Новый,
дорогостоящий и пока малораспространенный
вариант ПЦР, позволяющий более точно
определять количество ДНК в образце.

В
данном варианте реакционная смесь,
содержащая флуоресцентный краситель,
разбивается на огромное число
микроскопических объемов (например,
капелек в эмульсии).

После протекания
ПЦР анализируется, в какой доле капелек
реакция оказалась положительной и,
соответственно, наблюдается флуоресценция.
Эта доля будет пропорциональна числу
искомых молекул ДНК в образце.

ПЦР
с обратной транскрипцией

В
данном случае перед тем или иным вариантом
ПЦР производится реакция обратной
транскрипции (РНК в ДНК) с использованием
фермента ревертазы. Таким образом, этот
метод позволяет проводить качественное
или количественное обнаружение молекул
РНК. Это может использоваться для
детекции РНК-содержащих вирусов или
определения уровня транскрипции
(количества мРНК) того или иного гена.

Рисунок 1. Этапы ПЦР. Красным цветом
обозначены праймеры.

Рисунок 2.Накопление двуцепочечных
молекул ДНК, ограниченных праймерами,
в ходе ПЦР.

Рисунок 3.Динамика
реакции ПЦР при разных изначальных
концентрациях искомых молекул ДНК в
пробе.
(а) – наибольшая концентрация
(б)
– промежуточная концентрация
(в) –
наименьшая концентрация

Рисунок 4.Агарозный электрофорез
продуктов ПЦР. К+ – положительный
контроль (заведомо присутствует искомая
ДНК).
1-7 – исследуемые образцы (из них
1-2 – положительные, 3-7 – отрицательные).
K- –отрицательный контроль (заведомо
отсутствует искомая ДНК).
Во многих
случаях помимо целевого продукта видны
более легкие неспецифические продукты
реакции (праймер-димеры).

Рисунок 5. Способы
детекции при использовании ПЦР в реальном
времени.
(а) – интеркалирующий краситель
– флуоресцирует при связывании с
двухцепочечной ДНК
(б) – зонд Taqman –
флуоресценция возникает при расщеплении
зонда ДНК полимеразой с 5’-3’ эндонуклеазной
активностью за счет разделения флуорофора
и гасителя.

(в) – зонд MolecularBeacon — флуоресценция возникает при гибридизации
зонда с целевым фрагментом за счет
пространственного отдаления флуорофора
и гасителя
(г) – зонды LightCycler —
флуоресценция акцептора возникает при
гибридизации зондов (содержащих акцептор
и донор) с целевым фрагментом за счет
резонансного переноса энергии
флуоресценции (FRET).

Источник: https://studfile.net/preview/1778291/

Анализы методом ПЦР

Полимеразно-цепная реакция считается одним из самых точных и быстрых методов диагностики многих инфекционных заболеваний. Успешно применяется она также в криминологии для упрощения процесса идентификации преступников, с ее помощью с высокой точностью устанавливают отцовство.

Суть метода ПЦР

Каждый живой организм, в том числе бактерии и вирусы, имеют уникальные гены, входящие в структуру ДНК или РНК в определенной последовательности. Во время исследования методом ПЦР генетический материал многократно копируется под воздействием ДНК-полимеразы и специальных температурных циклов.

Существуют два основных метода полимеразно-цепной реакции:

1. Классический метод — выделение генетического материала возбудителя методом электрофореза;
2. ПЦР в режиме «реального времени».

Методика состоит из трех основных этапов:

• Подготовка исследуемого образца;
• Амплификация ДНК;
• Детекция (идентификация) генетического материала предполагаемого возбудителя.

Для проведения исследования ПЦР-лаборатория должна быть разделена на 3 зоны, каждый этап реакции проводится строго в предназначенном для него помещении. Каждая зона должна быть снабжена необходимым оборудованием, дозаторами, расходным материалом, защитной одеждой, используемыми только в данном помещении.

После регистрации и маркировки образцов, в кабинете пробоподготовки происходит выделение ДНК или РНК возбудителя из исследуемого материала путем воздействия определенной температуры и специальных реагентов. Затем начинается процесс амплификации – создания многочисленный копий уникального фрагмента ДНК. Он состоит из 3 основных этапов:

• Денатурация ДНК – под воздействием высокой температуры (95 градусов) двойная спираль ДНК расплетается на 2 цепочки.
• Отжиг праймеров – к окончаниям цепей ДНК присоединяются специальные синтетические соединения (праймеры), идентичные генетической информации на концах искомых фрагментов нуклеиновых кислот. Температура, нужная для присоединения праймера, индивидуальна для конкретного случая, колеблется в диапазоне от 50 до 65 гр.С.
• При помощи фермента ДНК-полимеразы при 70 – 72 градусов между двумя праймерами достраивается аналогичный участок ДНК (ампликон). В качестве «строительного материала» используются специальные вещества, добавляемые в пробирку.

Циклы амплификации повторяются несколько раз, следовательно, выделяемая ДНК многократно копируется, что упрощает процесс ее идентификации. Идентификация может проводиться визуально после проведения процедуры электрофореза продуктов амплификации в агарозном геле, либо автоматически при использовании методики реал тайм.

При исследовании методом ПЦР в режиме «реального времени» амплификация и детекция происходят одновременно в специальных приборах. Данный метод наиболее предпочтительный, так как исследование проводится в закрытых пробирках, снижается риск контаминации и, следовательно, выдачи ложно-положительных результатов.

Плюсы и минусы метода

Преимущества ПЦР-диагностики:

• Исследование занимает всего несколько часов, в отличие от длительных классических микробиологических методов;
• Высокая специфичность от 95% до 100%, т.к. искомый фрагмент ДНК уникален для каждого конкретного микроорганизма;
• Высокая чувствительность метода, обнаружить возбудителя можно, даже если в исследуемом образце он представлен всего одной клеткой;
• Идентифицировать возбудителя можно как качественным, так и количественным методом. Это очень важно при выделении условно-патогенных микроорганизмов, которые в небольшом количестве не вызывают заболевания;
• Возможность определить генотип возбудителя (гепатит С, ВИЧ-инфекция). Необходимо это для рационального лечения и прогноза возможных осложнений;
• Возможность выявить генетическую предрасположенность к болезни, тем самым предупредить ее развитие;
• Можно выделить практически любой источник инфекции, также современные методики позволяют выявить совокупную микрофлору в исследуемом образце, например, биоценоз влагалища.

Недостатки:

• Возможность получения как ложноположительного, так и ложноотрицательного образца при несоблюдении правил забора образца, ошибок при проведении исследования;
• Высокая стоимость анализа.

Применение

Исследовать методом ПЦР можно практически любой образец (кровь, моча, ликвор, соскобы с цервикального канала и уретры, волосяные луковицы, сперма и т.д.).

Широко используется данная методика для диагностики ЗППП (гонорея, хламидиоз, уреаплазмоз, микоплазмоз, трихомониаз).

С ее помощью можно выявить возбудителей туберкулеза, дифтерии, пневмонии, вирусных гепатитов, ВИЧ-инфекции, токсоплазмоза, цитомегаловирусной и герпетической инфекции, сальмонеллеза и др.

Применяется полимеразно-цепная реакция для установления отцовства путем сравнения ДНК родителя и ребенка, выявления генетических аномалий и наследственной предрасположенности организма к различным заболеваниям.

Подготовка к сдаче анализа

• Кровь рекомендуется сдавать строго натощак.
• Перед взятием мазка из уретры или цервикального канала следует в течение трех дней воздержаться от половой жизни, сдавать анализ необходимо не раньше, чем через месяц после окончания курса антибиотикотерапии, иначе результат может быть ложноположительным. Методом ПЦР выявляется ДНК даже мертвого возбудителя, поэтому проводить исследование лучше после полного обновления клеток.
• Мочу следует собирать в стерильную емкость.

Ответ чаще всего будет готов через пару дней, в зависимости от возможностей лаборатории.

Расшифровка результатов

При использовании качественной методики может быть только 2 варианта ответа: положительный или отрицательный. Положительный результат свидетельствует о наличии выделяемого микроорганизма в образце, отрицательный – об отсутствии.

Количественный результат должен оценивать лечащий врач, применяется индивидуальный подход в каждом конкретном случае. Специалист, учитывая полученный ответ, решает вопрос о необходимости лечения, дозировке препаратов, уточняет форму и стадию заболевания.

При определении генетического профиля (предрасположенности к тромбофилии, раку молочной железы) после расшифровки результата врач может оценить степень риска развития заболевания, а также назначить специальную диету, профилактические мероприятия.

Источник: http://comp-doctor.ru/zoj/pcr.php